Células-tronco em Odontologia

Células-tronco em Odontologia

Ana Prates Soares*, Luégya Amorim Henriques Knop*, Alan Araujo de Jesus **, Telma Martins de Araújo***

Resumo

A RTIGO I NÉDITO

Introdução: existe um grande interesse no desenvolvimento de técnicas para a manipulação

de células-tronco, no intuito de instituirem-se tratamentos restauradores de tecidos e órgãos.

Para que a bioengenharia seja eficaz, faz-se necessária a presença de três fatores: as próprias

células-tronco, uma matriz extracelular e fatores de crescimento. Existem inúmeros fatores de

crescimento envolvidos no desenvolvimento do órgão dentário. Por isso pesquisadores ainda

não foram capazes de formar um órgão completo, embora existam diversos estudos evidenciando

a formação de esmalte e dentina a partir de células-tronco isoladas da polpa dentária.

Recentemente,também foram isoladas células-tronco da polpa dos dentes decíduos.

Sabe-se que estas células são altamente proliferativas, sendo de grande importância para

o cirurgiãodentista o conhecimento do seu comportamento biológico e técnicas de obtenção.

Objetivo: este estudo teve como objetivo realizar uma revisão de literatura acerca das atuais tendências das pesquisas com células-tronco na Odontologia, além de discorrer sobre os fatores implicados para o sucesso na utilização prática dessas células.

Palavras-chave: Células-tronco. Bioengenharia. Pesquisa em Odontologia.

INTRODUÇÃO

A perda dentária e dos tecidos periodontais pode resultar em movimento dos dentes remanescentes, dificuldade na mastigação, fonação, desequilíbrio na musculatura e comprometimento da estética dentária e do sorriso, comprometendo a auto-estima.

Atualmente existem diversas terapias para substituição dos órgãos dentários, todas elas

baseadas em técnicas não-biológicas e sujeitas a falhas. Apesar desta condição ser uma anormalidade comum e não ameaçar a vida do paciente, esforços têm sido dirigidos para

o desenvolvimento de mecanismos para a utilização de células-tronco na reposição de tecidos bucais.

Para a bioengenharia é essencial uma tríade

* Acadêmicas do Curso de Graduação em Odontologia - UFBA.

** Especialista em Prótese Dental (ABO/Ba). Mestre em Odontologia (FOUFBA). Doutorando em Biotecnologia UEFS/FIOCRUZ.

*** Doutora e Mestre em Ortodontia – UFRJ. Professora Titular de Ortodontia UFBA. Diplomada pelo Board Brasileiro de Ortodontia e Ortopedia Facial. R Dental Press Ortodon Ortop Facial 33

Maringá, v. 12, n. 1, p. 33-40, jan./fev. 2007 12

composta por células-tronco ou progenitoras, uma matriz que funcione como arcabouço e proteínas sinalizadoras, denominadas fatores de crescimento, como estímulopara diferenciação celular (Fig. 1). O objetivo desta revisão de literatura foi dis- correr acerca das técnicas da bioengenharia e relatar

os resultados obtidos nos experimentos com células-tronco, bem como suas reais tendências na aplicação em Odontologia. Células-tronco em Odontologia

CÉLULAS-TRONCO OU PROGENITORAS

Células-tronco são definidas como células indiferenciadas com grande capacidade de auto-renovação e de produzir pelo menos um tipo celular altamente especializado.

Existem duas categorias de células-tronco: as células-tronco embrionárias pluripotentes

e a linhagem de células unipotentes ou multipotentes,denominadas células-tronco adultas,

que residem em tecidos diferenciados.A maior vantagem do uso de células-tronco

embrionárias é a sua capacidade de proliferação e de diferenciação em diversos tipos celulares. Mas existem desvantagens, como a sua instabilidade genética, a obrigatoriedade de sua transplantação para hospedeiros imunocomprometidos, o risco de formação de teratocarcinomas e de contaminação através do seu cultivo em fibroblastos de ratos,

além da questão ética. A viabilidade do uso de células-tronco adultas na regeneração e reconstrução de tecidos tem suscitado grande interesse na comunidade científica,

dado o aumento de leis em diversos países que proíbem o uso de células-tronco

embrionárias em pesquisa.Já as células-tronco adultas apresentam a vantagem

de serem autogênicas,não incorrendo em limitações morais,e responsivas aos fatores de

crescimento inerentes ao hospedeiro.No entanto também apresentam desvantagens,

como o fato de não serem pluripotentes,a dificuldade de obtêlas,purificá-las e cultivá-las

vitro,além de sua presença em menor quantidade nos tecidos. A principal fonte de células-tronco adultas é a medula óssea.Estas células têm a capacidade de se diferenciarem

em células dos tecidos ósseo,adiposo,cartilaginoso e muscular,o que demonstra sua alta

plasticidade.Inúmeros estudos têm isolado células alta Dental Press Ortodon Ortop Facial

mente proliferativas, derivadas da polpa dentária.Constatou-se que tais células são multipotentes e possuem a capacidade de autorenovação

e de diferenciação em diversos tipos celulares.Foi observada uma conversão fenotípica

destas células, através da expressão de proteínas adiposas (PPAR 2, sigla do inglês peroxisome

proliferator activated receptor2,e a lipoproteína lipase),após o estímulo por um meio de

cultura com alto potencial indutivo adipogênico.Ademais, as células-tronco da polpa dentária expressaram nestina e proteína glial fibrilar ácida (GFAP, sigla do inglês glial fibrilar acid protein),que são marcadores de precursores neurais e células gliais,respectivamente.

Existem evidências de que células-tronco de dentes decíduos são similares àquelas encontradas no cordão umbilical. Quando comparadas às células-tronco provenientes da medula óssea e da polpa de dentes permanentes, notou-se que as SHED (stem cells from human exfoliated deciduous teeth) apresentam uma maior taxa de proliferação. Além disso,

os dados desse estudo indicam que as SHED possuem habilidade de se diferenciarem em

células odontoblásticas funcionais, adipócitos e células neurais,

além de estimularem a osteogênese após transplantação.

Pesquisas demonstraram que células-tronco da polpa requerem um meio indutor apropriado e um arcabouço composto por hidroxiapatita/tricálciofosfato para induzir a formação de osso,

cemento e dentina in vivo. Alguns autores demonstraram a adipócitos

R Dental Press Ortodon Ortop Facial formação de tecido ósseo fibroso autólogo a partir

de células-tronco provenientes de polpas de indivíduos com idades acima de 30 anos,

assim como a diferenciação dessas células em odontoblastos.Os marcadores para as células-tronco são de ex-trema importância, pois estas células residem em diferentes locais dentro do tecido. São necessários mais estudos sobre marcadores específicos que possam identificar nichos de células-tronco presentes na polpa dentária

in situ e sobre como se dá o desenvolvimento desses nichos. É possível que as células-tronco da polpa humana e do ligamento periodontal estejam associadas com a microvasculatura. Atualmente são utilizados os seguintes marcadores microvasculares, para localização de tais células: STRO-1 (marcador de células do estroma), Fator

Von Willebrand e CD146 (molécula da superfície de células endoteliais). A expressão

da telomerase celular em tecidos normais parece estar associada à presença de células-tronco.

Técnicas de detecção in situ dessa ribonucleoproteína têm a possibilidade de atuarem como

marcadores celulares odontoblastos. células-tronco isoladas células neurais

FIGUR Células-tronco isoladas do tecido pulpar de dentes decíduos têm alta capacidade proliferativa e são capazes de se diferenciarem em odontoblastos

maduros, adipócitos ou células neurais.

Pesquisadores cultivaram células-tronco da medula óssea e da polpa humana, provenientes de terceiros molares impactados, e analisaram a expressão genética dessas células, através

do método cDNA Microarray.Foi demonstrado um padrão gênico altamente similar entre esses dois tipos celulares, com exceção de alguns genes, incluindo o IGF-2 (fator de crescimento insulínico-2, sigla do inglês insulinic growth factor-2) e colágeno tipo XVIII 1,no entanto ainda é desconhecida a expressãodessa diferença.

MATRIZ

Para bioengenharia de tecidos, uma matriz é essencial, pois fornece o arcabouço necessário para o transporte de nutrientes, oxigênio e resíduos metabólicos.Esse arcabouço deve ser biocompatível, não irritante e resistente.

A matriz é composta por materiais sintéticos ou naturais. Os componentes da matriz funcionam ativando morfogenes das células implantadas, enquanto esta é gradualmente degradada

e substituída pelo tecido regenerado. Para a formação de tecido dentário têm sido utilizadas

as matrizes PGA (ácido poliglicólico, sigla do inglês polyglycolic acid) e PLGA (ácido poli co-glicolíde copolímero, sigla do inglês polico-glycolide copolymer), ambas apresentando similaridade no suporte de crescimento de tecidos dentários altamente organizados.

Também pode ser usado um sistema de matriz com a configuração tri-dimensional, a partir do colágeno tipo I, para o cultivo de células-tronco em experimentos, visando sua diferenciação em odontoblastos. Neste estudo objetivou-se avaliar a resposta de células-tronco provenientes do primeiro arconbranquial de ratos ao estímulo por TGF1(sigla do inglês transforming

growth factor1) eDNCP (proteína não-colagênica da matriz extracelular dentária,

sigla do inglês dentin non colagenic protein) através da expressão de proteínas características

de odontoblastos.Apenas no grupo tratado somente com fator de crescimento TGF1 não

houve a formação de tecido semelhante ao complexo dentino-pulpar, sugerindo que proteínas derivadas da matriz extracelular desempenham uma função essencial na diferenciação odontoblástica.Fibroblastos isolados a partir da polpa dentária foram cultivados em matriz composta por fibras de ácido poliglicólico e, após 60 dias, exibiram celularidade similar à encontrada na polpa humana normal, indicando que esta matriz apresenta boas propriedades para a bioengenharia R Dental Press Ortodon Ortop Facial.

FATORES DE CRESCIMENTO

A morfogênese dentária envolve uma série de interações dinâmicas e recíprocas entre o ectoderma e o mesênquima. Os fatores de crescimento são proteínas secretadas extracelularmente que governam a morfogênese durante tais interações e compreendem cinco famílias protéicas: proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs, sigla do inglês bone morphogenetic protein); fatores de crescimento para fibroblastos (FGFs, sigla do inglês fibroblast growth factor

); proteínas Hedgehog (Hhs), proteínas wingless e int-related (Wnts) e fator de necrose tumoral

(TNF, sigla do inglês tumor necrosis factor). Apesar destas famílias distintas estarem envolvidas

no desenvolvimento dentário, as BMPs são suficientes para a formação de dentina terciária. Alguns autores demonstraram ainda que a regeneração da polpa induzida por hidróxido de cálcio é mediada pela sinalização Notch célula-célula. Os resultados foram

consistentes para afirmar que esta sinalização controla o destino de célulastronco provenientes da polpa, durante a regeneração da mesma. A família BMP faz parte da super-família TGF, composta de 25 fatores moleculares. As BMPs podem ser divididas em 4 sub-famílias distintas: a primeira BMP-2 e 4; a segunda BMP-3 e BMP-3B, esta última também conhecida como fator de crescimento/diferenciação 10 (GDF-10, sigla do inglês growth/differentiation factor); a terceira BMPs 5, 6, 7 e 8 e a quarta GDFs 5,

6 e 7, também conhecidas por proteínas morfogenéticas 1,2 e 3 derivadas da cartilagem 20.

15 20 Em um estudo observou-se a expressão de BMP2, BMP-4, BMP-7, BMP-8, GDF-5 e GDF-6 através do método de hibridização e posterior análise com PCR nas polpas dentárias de incisivos de ratos. Os autores afirmaram que tais fatores são críticos para o desenvolvimento dentário e reparo pulpar. Não foi detectada a expressão de BMP-3 neste tecido. As BMPs também são expressas no epitélio estrelado do órgão do esmalte durante a fase de capuz e estão associadas com a diferenciação dos ameloblastos e odontoblastos . O hormônio

de crescimento pode induzir a expressão dessas BMPs durante a formação dentária.

No início da morfogênese dentária, BMP-2, BMP-12 4 e BMP-7 agem como importantes sinalizadores epiteliais que regulam a diferenciação do mesênquima derivado da crista neural em uma linhagem odontogência. Tais sinalizadores ainda determinam o número

e a posição das cúspides dos dentes 12, 28. Células da polpa dentária de porcos, cultiva-

29 das e tratadas com BMP-2, foram transplantadas para dentes despolpados de cães, com o objetivo de observar a diferenciação odontoblástica e a formação de dentina. A

expressão do RNAm de sialofosfoproteínas da dentina (Dspp, sigla do inglês dentin sialophosphoprotein) e de metaloproteinases-20 da matriz (MMP-20,

em inglês matrix metalloproteinases-20) confirmou a diferenciação de células pulpares em odontoblastos.Tal resultado comprovou o efeito estimulatório da BMP-2 para a formação de dentina.Foi demonstrado que a BMP-4 é expressa pelos pré-odontoblastos da bainha epitelial da raiz.Ademais, BMP-2 e BMP-7 são observadas em pré-odontoblastos e em odontoblastos durante um período relativamente curto de diferenciação, estando ausentes em odontoblastos maduros localizados na superfície da dentina coronária e radicular. BMP-3 foi localizada em ambas as células na área da raiz, mas não em odontoblastos diferenciados e secretores presentes na coroa dentária. Os membros da família FGF agem em diferentes momentos da odontogênese, desde o início do desenvolvimento dentário até a formação da última cúspide

. FGFs regulam a expressão de diversos genes e induzem a proliferação do mesênquima.

Dentre os três membros da família Hedgehog (Hh) presentes nos vertebrados, Shh (sigla do inglês Sonic Hedgehog) é o único ligante Hh expresso nos dentes, sendo expresso durante

o desenvolvimento inicial do germe dentário.Com o objetivo de investigar a função da proteína Shh,pesquisadores bloquearam sua sinalização através de anticorpos neutralizantes e observaram que Shh possui duas funções no início da odontogênse.A primeira é durante a formação do botão dentário, ao estimular a proliferação epitelial, e a segunda é o aumento da sobrevida da célula epitelial duranteo estágio de capuz.A maioria dos genes Wnt é expressa pelo epité lio dentário. Sugere-se que o Wnt7b interaja na sinalização Shh para estabelecimento dos limites entre o ectoderma oral e dentário, posicionando assim os locais de formação das estruturas dentárias.Sabe-se que os fatores de necrose tumoral (TNF) são cruciais na formação das cúspides dosmolares.

APLICAÇÕES EM ODONTOLOGIA

A terapia com células-tronco adultas geralmente é precedida pela compreensão de todas as suas propriedades, o controle de sua proliferação e os fatores que

determinam sua diferenciação.A regeneração de um órgão dentário não é simples,

pois seu desenvolvimento é determinado por interações complexas e inúmeros fatores de crescimento e, ainda, a diferenciação celular está ligada a mudanças morfológicas no

decorrer da formação do germe dentário. Tem sido proposta a utilização de células-tronco adultas em diversas áreas da Odontologia. Em um estudo in vitro, células-tronco mesenquimais

obtidas da medula óssea de ratos foram isoladas e induzidas a se diferenciarem em

células condrogênicas e osteogênicas através de estímulo com fator de crescimento tumoral

(TGF-1).As mesmas foram encapsuladas em Células-tronco em Odontologia duas camadas de matriz composta por hidrogel de polietilenoglicol, moldadas em forma de côndilo de

humanos. Esses moldes de acrílico foram implantados em dorsos de ratos imunodeficientes. Foi observada a formação de uma estrutura condilar após 8 semanas da implantação. Tal achado representa uma ferramenta útil para um futuro desenvolvimento de côndilos

mandibulares através da engenharia tecidual. Em outra pesquisa, células-tronco mesenqui-

mais provenientes de porcos foram isoladas, cultivadas em matriz de ácido poli-dl-láctico coglicólico e incubadas por 10 dias em meio de cultura com suplemento osteogênico.

Posteriormente a este período, as amostras foram transplantadas para defeitos

ósseos mandibulares induzidos cirurgicamente e após 6 semanas realizou-se a análise histológica, clínica e radiográfica.Observou-se que os defeitos foram preenchidos com um tecido denso,semelhante ao osso, apresentando osteoblastos, osteócitos, vasos sanguíneos e osso trabeculado.Inúmeros esforços têm sido direcionados para a demonstraram a presença de células tronco-adultas no ligamento periodontal, com propriedade clonogênica e alta

taxa proliferativa. Essas células foram estimuladas in vitro a diferenciarem-se em células tipo cementoblastos, através de um meio rico em L-ascorbato-2 fosfato, dexametasona e fosfato inorgânico; após 4 semanas observou-se acumulação cálcica, embora em menor proporção quando comparada com as células-tronco provenientes da medula óssea e da polpa dentária.

A análise imunohistoquímica e Western blotting demonstraram que as células-tronco

do ligamento periodontal expressaram uma variedade de marcadores cementoblásticos/osteoblásticos. Ao serem transplantadas para ratos

imunocomprometidos as células formaram uma estrutura semelhante ao cemento/ligamento

periodontal. Em defeitos criados cirurgicamente na área periodontal dos molares inferiores dos ratos, as células se integraram ao ligamento periodontal em duas das seis amostras

e,ocasionalmente,uniram a superfície do osso alveolar ao dente. Esses achados

regeneração periodontal. Laino et al. implicam em uma possível função das células-tronco

na regeneração tecidual periodontal,sendo necessários estudos mais aprofundados.O objetivo da Odontologia conservadora é restaurar ou regenerar os tecidos dentários para manter a

vitalidade, a função e a estética do dente. Gronthos et al. iniciaram estudos para isolar células-tronco da polpa dentária a partir de terceiros molares humanos impactados. Em meio de cultura composto por L-ascorbato-2-fosfato, glicorticóide e fosfato inorgânico,

foi observada a capacidade de tais células formar em depósitos cálcicos in vitro.Após

transplantação em ratos imunocomprometidos, as células-tronco pulpares

exibiram habilidade de formar uma estrutura semelhante ao complexo dentina-polpa,

composto de uma matriz de colágeno tipo I altamente organizada, perpendicular à camada tipo odontoblástica, e tecido fibroso contendo vasos sanguíneos, análogo à polpa encontrada

em dentes humanos normais. Outros pesquisadores cultivaram o mesmo tipo celular

em meio indutor de mineralização semelhante e observaram a formação de hidroxiapatita com pequenas quantidades de carbonatos, característicos de apatitas biológicas. A matriz extracelular fosfoglicoprotéica não-colagênica(MEPE,sigla do inglês matrix

extracellular phosphoglycoprotein) foi identificada recentemente no tecido dentário,

tendo o peptídeo Dentonina derivado de sua seqüência gênica. A ação da Dentonina

sobre as células-tronco da polpa foi avaliada. Observou-se um aumento na taxa de proliferação

dessas células, sendo possível o uso deste peptídeo na regeneração da polpa em resposta a injúrias como traumas e cáries.São necessários mais estudos para aplicação in vivo desta terapia. Em um estudo, foi testada a capacidade do epitélio odontogênico de estimular células-tronco embriogênicas e mesenquimais, provenientes dos tecidos neural e medula óssea,

a expressarem genes do desenvolvimento dentário e, assim, substituírem o mesênquima

dentário na bioengenharia. Em amostras com células embriogênicas e neurais,

observou-se a expressão de Dspp, gene expresso por odontoblastos, sugerindo que apesar de não haver formação dentária,há o estímulo para a diferenciação celular. Um modelo de aplicação clínica da terapia endodôntica foi proposto por Nakashima , baseado no

cultivo, proliferação e diferenciação de células-tronco pulpares em odontoblastos,

sua inserção em uma matriz moldada do preparo cavitário que apresente exposição

pulpar e o posicionamento da matriz no dente.Assim haveria a proliferação

dos odontoblastos e formação de dentina tubular funcional. Stem cells in Dentistry

Abstract 18 Na busca pela formação de um órgão dentário completo, foram desenvolvidos experimentos em ratos,utilizando primórdios da lâmina dentária ao invésde populações de células-tronco isoladas. Isto evidencia uma dificuldade na manipulação de todos

os fatores envolvidos no desenvolvimento de um órgão dentário.Além desta problemática é evidente a necessidade da inserção e funcionabilidade do órgão formado, de maneira

que possa se integrarao sistema estomatognático.Pesquisadores observaram que células dentárias no estágio de botão, obtidas de ratos recém-nascidos, cultivadas in vitro durante 6 dias e transplantadas para dorsos de ratos imunocomprometidos, apresentaram resultados ótimos na formação de coroas dentárias maduras, com características muito semelhantes aos

dentes formados naturalmente. Para determinar se rudimentos dentários em fase de campânula poderiam formar um órgão dentário, quando transplantados para uma região desdentada da maxila em ratos. Verificou-seque após 26 dias da transplantação houve formação de um dente ectópico, histologicamente normal, com presença de dentina,

esmalte e um tecido

similar

ao ligamento periodontal.

Sendo identificada

pelos

autores uma possibilidade de transplantação

de

primórdios

dentários e seu subseqüente desenvolvimento

em humanos.

Tal

possibilidade leva

a discussões

sobre a ética na experimentação com embriões

em

desenvolvimento

adultos, foi desenvolvido um experimento

23

.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Existe um grande avanço nos experimentos com células-tronco adultas provenientes de tecidos bucais.

O seu fácil acesso e o fato de não serem órgãos vitais constituem um atrativo para testes de praticidade e viabilidade de técnicas da bioengenharia.

É possível que, num futuro próximo, se utilize da bioengenharia na terapia endodôntica e periodontal, apesar de, atualmente,a ciência se encontrar distante de desenvolver órgãos dentários completos a partir de células-tronco, devido aos mecanismos complexos da formação dentária.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à SempToshiba, pelo apoio constante ao Centro de Ortodontia e Ortopedia

Facial Prof. José Édimo Soares Martins FOUFBA.

REFERÊNCIAS

1. ABUKAWA, H.; SHIN, M.; WILLIAMS, W. B.; VACANTI, J. P.;KABAN, L. B.; TROULIS, M. J. Reconstruction of mandibular defects with autologous tissue-engineered bone. J Oral Maxillofac

Surg, Philadelphia, v. 62, no. 5, p. 601-606, 2004.

2. ALHADLAQ, A.; MAO, J. J. Tissue-engineered neogenesis ofhuman-shaped mandibular condyle from rat mesenchymal stemcells. J Dent Res, Alexandria, v. 82, no. 12, p. 951-956, 2003.

3. BATOULI, S.; MIURA, M.; BRAHIM, J.; TSUTSUI, T. W.; FISHER,L. W.; GRONTHOS, S.; ROBEY, P. G.; SHI, S. Comparison ofstem-cell-mediated osteogenesis and dentinogenesis. J Dent

Res, Alexandria, v. 82, no. 12, p. 976-981, 2003.

4. COBOURNE, M. T.; HARDCASTLE, Z.; SHARPE, P. T. Sonichedgehog regulates epithelial proliferation and cell survival inthe developing tooth germ. J Dent Res, Alexandria, v. 80, no.

11, p. 1974-1979, 2001.

5. DENG, M.; SHI, J.; SMITH, A. J.; JIN, Y. Effects of transforming growth factor beta1 (TGFbeta-1) and dentin non-collagenous proteins (DNCP) on human embryonic ectomesenchymal cells

in a three-dimensional culture system. Arch Oral Biol, Oxford,v. 50, no. 11, p. 937-945, 2005.

6. DUAILIBI, M. T.; DUAILIBI, S. E.; YOUNG, C. S.; BARTLETT, J. D.;VACANTI, J. P.; YELICK, P. C. Bioengineered teeth from culturedrat tooth bud cells. J Dent Res, Alexandria, v. 83, no. 7, p. 523528,2004.

7. GRONTHOS, S.; BRAHIM, J.; LI, W.; FISHER, L. W.; CHERMAN,N.; BOYDE, A.; DENBESTEN, P.; ROBEY, G. P.; SHI, S. Stem cellproperties of human dental pulp stem cells. J Dent Res, Alexandria,

v.81, no. 8, p. 531-535, 2002.

8. GRONTHOS, S.; MANKANI, M.; BRAHIM, J.; GEHRON ROBEY,P.; SHI, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) invitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci USA, Washington, D. C.,

v. 97, no. 25, p. 13625-13630, 2000.

9. HARADA, H.; MITSUYASU, T.; TOYONO T.; TOYOSHIMA, K.Epithelial stem cells in teeth. Odontology, Tokyo, v. 90, no. 1,p. 1–6, 2002.005.